الکتروفورز

اصول کلی روش الکتروفورز
(Electrophoresis)

(Electrophoresis)الکتروفورز
الکتروفورز یکی از تکنیکهاي آنالیتیکی قدرتمند در جداسازي و آنالیز دامنه وسیعی از آنالیتهاي یونیزه محسوب
میگردد. آنالیتهایی که بطور ویژه مورد توجه قرار میگیرند عبارتند از: پروتئینها, پپتیدها, آمینواسیدها, اسیدهاي
نوکلئیک و اولیگونوکلئوتیدها, نوکلئوزیها, اسیدهاي آلی و آنیونها و کاتیونهاي کوچک موجود در مایعات و بافتهاي
بدن. اصطلاح الکتروفورز اشاره به حرکت همه ترکیبات یا ذرات باردار در یک محلول )محیط مایع( تحت تاثیر جریان
الکتریکی دارد.
ترکیبات شیمیایی داراي بار الکتریکی به سمت قطب آند و یا کاتد )با توجه به نوع بار الکتریکی( حرکت
مینمایند. آمفولیتها) (Ampholytesترکیباتی هستند که وابسته به نوع محیط )قلیایی بودن یا اسیدي بودن(
داراي بار منفی یا بار مثبت میباشند. از آنجایی که پروتئینها حاوي گروههاي –NH2, -COOHمیباشند و نیز
بارهاي موجود در اسیدهاي نوکلئیک میتوانند به صورت مثبت و یا منفی باشند, در محلولها داراي رفتاري مشابه
رفتار آمفولیتها میباشند.
سرعت حرکت ترکیبات موجود در یک نمونه در الکتروفورز به عوامل زیر وابسته است:
.1بار الکتریکی خالص یون .
.2اندازه و شکل یون .
.3شدت میدان الکتریکی.
. (Support medium) . خواص محیط پایه4
.5دماي محیط الکتروفورزي.
حرکت الکتروفورزي) (μبرحسب تعریف عبارت است از میزان حرکت ذرات)برحسب ( cm/sدر واحد میدان
الکتریکی)برحسب (Volt/cmکه با μنشان داده میشود و برحسب cm2/V.sبیان میگردد:
: μحرکت الکتروفورزي
: Qبار الکتریکی خالص یون
: rشعاع یون
: ηویسکوزیته محیط)بافر(
بطورکلی نیروهاي تاثیر گذارنده بر حرکت الکتروفورزي را میتوان به دو گروه تقسیم نمود:
.1نیروي رانشی یا جلوبرنده ) (Driving forceکه مرتبط با میدان الکتریکی یون مربوطه است.
.2نیروي بازدارنده ) (Retarding forceکه مربوط به مقاومت محیط نگهدارنده است.
با توجه به معادله بالا مشخص میگردد که حرکت الکتروفورزي ارتباط مستقیم با بار خالص یون) (Qو ارتباط
معکوس با اندازه ملکول) (rو ویسکوزیته محیط الکتروفورزي) (ηدارد. هنگامی که الکتروفورز در حال انجام است
به مرور دماي محیط پایه و بافرها افزایش مییابد که منتج به تبخیر حلال میگردد, این اثر )خشک کنندگی( سبب
صعود بافر از هردو بخش بافري)درون دو تانک بافري( به درون محیط پایه میگردد, این جریان دوطرفه بر حرکت
یونها تاثیر میگذارد). (Wick flow

وسایل و مواد مورد نیاز:
یک دستگاه )سیستم( الکتروفورز شامل بخشهاي زیر است:
دو تانک بافر) (Buffer boxesکه بافرهاي الکتروفورزي در آن ریخته میشود
الکترودها
محیط پایه الکتروفورزي )(Support media
صفحه پوشاننده ) (Coverجهت جلوگیري از تبخیر .
سیستم تامین کننده جریان الکتریکی )(Power supply
بافر)تامپون(
محیط پایه الکتروفورزي )(Support media
ژل نشاسته نخستین ژلی بود که براي جداسازي الکتروفورزي استفاده گردید. در حال حاضر از آگارز, استات
سلولز و پلیآکریلامید استفاده میگردد.
: (Agarose) آگارز
آگار پلیساکارید اسیدي کمپلکسی است که محتوي منومرهایی از گالاکتوز سولفاته است. آگارز در واقع
همان آگاري است. آگارز در واقع همان آگاري است که فاقد گروه سولفات است. ناخالصی در آگارز و وجود
آگار و آگاروپکتین)که داراي گروههاي سولفات و کربوکسیلیک اسید میباشند( موجب اختلال در حرکت ملکولها و
نیز در رنگآمیزي میگردد ولی در آگارز خالص به دلیل اینکه گروههاي قابل یونیزه مذکور وجود ندارد, کارایی
بیوشیمی عملی - رشته علوم آزمایشگاهی Electrophoresis ۴
بهتري در جداسازي ترکیبات به روش الکتروفورز )نسبت به ترکیبات مذکور( دارد. از لحاظ عملی محلولهاي بافر
حاوي 0/5 -1 gr/dLآگارز, ایجاد کننده ژلی با قدرت یونی مناسب براي جداسازي پروتئینها و قطعات DNAبا
طول 0/5تا 20هزار جفت باز ) (kilo base pair = kbpاست.
اندازه حفره موجود در ژل, بستگی به غلظت آگارز در بافر دارد. هر باند تفکیک شده حاوي چندین پروتئین با
حرکت الکتروفورزي یکسان است. در این نوع از محیطهاي الکتروفورزي, باندها بیشتر به صورت پهن دیده می-
شوند زیرا ژل آگارز نسبت به محیطهاي دیگر مانند استات سلولز نسبت پروتئینها از نفوذپذیري بالایی برخوردار می-
باشد.
استات سلولز:
کاغذها بیشتر از جنبه جداسازي ترکیبات با وزن ملکولی پایین حائز اهمیت میباشند. مزیت اصلی این محیطها
نازک بودن و قدرت مکانیکی آنهاست. این محیطها داراي حساسیت بیشتري میباشند زیرا به نمونه کمتري براي
ایجاد لکهها یا باندهاي قابل تشخیص دارند. کاغذ استات سلولز از جمله این محیطهاست. استات سلولز بوسیله قرار
دادن کاغذ سلولز در مجاورت انیدرید استیک ایجاد میگردد. گروه استیل بر روي گروههاي هیدروکسیل قند قرار
میگیرد.
پلیآکریلامید:
از پلیمریزاسیون آکریلامید در حضور حرارت ایجاد میگردد که ممکن است داراي پیوندهاي متقاطع یا فاقد
پیوندهاي متقاطع) (Cross linkباشد. ژل پلیآکریلامید پایدار در برابر حرارت بوده و شفاف است و همچنین
فاقد بار الکتریکی است به همین دلیل تداخلی که در ژل آگارز وجود داشت در اینجا وجود ندارد. به علت خاصیت
کارسینوژنیک)سرطانزایی( آکریلامید, باید توجه داشت که این ترکیب با سطح پوست برخورد نداشته باشد. ژل پلی-
آکریلامید از ترکیب آکریلامید و یک ماده رابط بنام – N,Nمتیلن بیس آکریلامید)بیس آکریلامید( شکل میگیرد.
بدین صورت که ملکولهاي آکریلامید بصورت طولی به هم متصل میگردند و ماده رابط نیز مسئول تولید پلهاي
عرضی متعدد بین رشتههاي آکریلامید است. خصوصیات فیزیکی ژل از قبیل اندازه منافذ, خاصیت الاستیکی ,
چگالی ژل و قوام مکانیکی متاثر از غلظت دو جزء تشکیل دهنده آن است. پلیمریزاسیون آکریلامید یک واکنش
رادیکالی است که توسط پراکسیداز یا انرژي فتوشیمیایی شروع میشود.
بافرها:
اعمال بافرها در فرایند الکتروفورز عبارت است از:
.1عبور دادن جریان الکتریکی
.2ثابت نگه داشتن pHمحیط
.3تعیین بار الکتریکی سطح ترکیب موجود در نمونه
بیوشیمی عملی - رشته علوم آزمایشگاهی Electrophoresis ۵
نوع بافر و خصوصیات آن از قبیل قدرت یونی, ظرفیت بافري و pHاز عوامل بسیار اساسی در الکتروفورز
محسوب میگردد. جداسازي ملکولها در الکتروفورز در یک با pHمعین و قدرت یونی خاص صورت میگیرد.
رنگ آمیزي ژلهاي الکتروفورزي ):(Staining
رنگ آمیزي ژلها )محیطهاي پایه(ي الکتروفورزي جهت آشکار شدن جایگاه باندهاي پروتئین و ... صورت می-
گیرد. انتخاب رنگها با توجه به نوع ژل و نوع ترکیب مورد جداسازي صورت میگیرد. میزان رنگ هر باند با میزان
پروتئین موجود در آن باند ارتباط دارد ولی این میزان تحت تاثیر عوامل دیگري نظیر نوع پروتئین و میزان
دناتوراسیون آن قرار میگیرد. وقتی از رنگ آمیزي پروتئینها استفاده میشود بخش لیپیدي لیپوپروتئینها یا
کربوهیدراتی گلیکوپروتئینها رنگ نمیشود. لذا مقادیر آنها کمتر از میزان واقعی برآورد خواهد شد.
- براي رنگآمیزي پروتئینها :استفاده از رنگهاي آمیدوبلاک) , (Amido blackکوماسی بریلیانت بلو
) , (CBBپانسو (Panseau S) Sو نیترات نقره .
- براي رنگآمیزي لیپوپروتئینها :
استفاده از رنگهاي سودان بلاک) , (Suddan blackکوماسی بریلیانت بلو ). Oil Red 0 , (CBB
- براي رنگآمیزي گلیکوپروتئینها :
. Periodic Acid Schiff (PAS) استفاده از رنگ
- براي رنگآمیزي اسیدهاي نوکلئیک :
استفاده از اتیدیوم بروماید) (Ethidium bromideو نیترات نقره .
- براي رنگآمیزي دهیدروژنازها :
استفاده از ) NADHداراي خاصیت فلوئورسان( و نمک تترازولیوم )نیتروبلوتترازولیوم(.
تشخیص و تعیین کمی اجزاي باندهاي تشکیل شده :
معمولترین روش تعیین مقدار اجزاي باندهاي الکتروفورزي, چگالیسنجی یا دانسیتومتري
) (Densitometryاست )به دستگاه مزبور نیز دانسیتومتر گفته میشود که به عنوان یک فتومتر فیلتردار و وسیله
رسم منحنی محسوب میگردد( که در آن از باندهاي مختلف یک محیط الکتروفورتیک شفاف )فاقد رنگ زمینهاي( و
بیوشیمی عملی - رشته علوم آزمایشگاهی Electrophoresis ۶
ثابت شده, اسکن تهیه و این اسکن به صورت توالی از قلههاي مجزا, به نام الکتروفورتوگرام نمایش داده میشود.
سطح منحنی زیر این قلهها متناسب با غلظت پروتئینهاي موجود در هر باند است. براي مثال, به این طریق می-
توان درصد پروتئینهاي موجود در هر کدام از باندهاي الکتروفورتیک پروتئینهاي سرم را بدست آورد. با ضرب کردن
این درصدها در میزان تام پروتئینهاي سرم, غلظت هر باند محاسبه میگردد )شکل زیر(.
م
انواع روشهاي الکتروفورزي
بسته به اینکه الکتروفورز در یک سطح افقی انجام گیرد یا در یک سطح عمودي به ترتیب به نوع روشهاي مذکور
الکتروفورز افقی و الکتروفورز عمودي گفته میشود. از سوي دیگر براساس نوع محیط پایه و مواد شیمیایی مورد
استفاده و همچنین نوع مکانیسم جداسازي, روشهاي الکتروفورزي تنوع زیادي پیدا کردهاند. ازجمله میتوان انواع زیر
را نام برد:
(Agarose Gel Electrophoresis or AGE) - الکتروفورز بر روي ژل آگارز
(Cellulose Acetate Electrophoresis or CAE) - الکتروفورز بر روي استات سلولز
(Polyacrylamide Gel Electrophoresis or PAGE) - الکتروفورز بر روي ژل پلیآکریلامید
بیوشیمی عملی - رشته علوم آزمایشگاهی Electrophoresis ٧
SDS-PAGE - روش
)که همان روش PAGEاست بعلاوه اینکه در اینجا از یک دترژانت به نام سدیم دو دسیل سولفات یا
SDSاستفاده میگردد که باعث اتصال به سطح ترکیباتی مانند پروتئینها گردیده و باعث ایجاد بار منفی بر سطح
همه آنها میگردد )شکل پایین(. میزان بار منفی تشکیل شده بر سطح پروتئینها به اندازه و وزن ملکولی آنها بستگی
دارد, بنابراین جداسازي در این روش بر اساس وزن ملکولی ترکیبات صورت خواهد گرفت(.
- ایزوالکتریک فوکوسینگ ) (Isoelectric focusing or IEFکه در این روش از محیط الکتروفورزي با
گرادیانی)شیبی( از pHاستفاده میگردد که پروتئینها براساس pHایزوالکتریکشان جداسازي میگردند.